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神經及腦組織中含唾液酸和岩藻糖的醣鏈結分子及相關酵素之研究(轉载)

腦組織中的醣鏈結分子包括乳糖脂質、神經結脂及醣蛋白,雖然已知這些共軛鏈結的醣分子,在許多的生物活性中扮演重要的角色;包括髓鞘質的生成和維持、細胞間的認知、胞突接合傳導、神經病理學等。但若要清楚詳細地以分子層次來解釋這些現象是非常困難的。我們這個主題計劃的目的,將針對神經及腦組織中的醣鏈結分子及相關酵素來作探討。我們將會執行下列工作:
(1)發展出新的化學方法,來合成針對唾液酸及岩藻糖合成轉移酵素的分子探針。

(2)藉著上述合成分子及質譜方法的分析,以獲取這些酵素的活化中心及拓樸訊息。

(3)調查在神經細胞黏滯分子 (NCAM)上的唾液酸聚合醣,它們的內酯化反應。

(4)對於所找出的酵素,鑑定出相同組織中所含對應的醣類型,並發現之間的關聯性。


這計劃的最終目標,是藉著中研院化學所及生物化學所的密切合作,與結合不同專業領域(包括合成化學、酵素學、質譜學、分析化學等)的共同探索,以明瞭醣加成反應的變化,對於腦及神經系統的複雜醣分子,是如何調控其各種生理功能。本整合型計畫分成三個子計畫,分別敘述於下:

細胞表面上唾液酸醣鏈結內酯化的化學及生化研究-吳世雄


已知在酸性條件下可以誘導催化寡唾液酸、聚唾液酸及唾液酸醣鏈結的內酯化;依據先前的文獻報導,得知在動物的腦組織中已純化出經內酯化的神經結脂( g a n g l i -oside),故在本計劃中將研究四個有關於唾液酸醣鏈結內酯化的問題:
首先,在化學環境中促使α2,8 三唾液酸及唾液酸α2,3 半乳糖雙醣進行內酯化反應,以毛細管電泳監測內酯化的程度,另外,在唾液酸α2,3 半乳糖雙醣之部分所形成的內酯環包括1 → 2 及1 → 4 內酯環,故將所得之各類內酯化產物溶解於DMSO中以,核磁共振光譜儀分析,所得之資料可分析及運算而得知內酯化唾液酸的動力學係數及其結構,並作分子的結構模擬。第二,由於在一些動物腦組織中已純化獲得,經內酯化的神經結脂,故在此將以豬及牛腦的丙酮萃取物為材料,分別以α2,8 雙、三、四、五、六唾液酸及各種含不同數目唾液酸的神經結脂當作受質,在中性條件下反應,分別以毛細管電泳及高效薄層層析法偵測是否存在唾液酸內酯酵素,另外,亦可以豬及牛腦的丙酮萃取物為材料,從中萃取純化神經結脂,進一步由這兩種之動物腦中偵測是否天然即存在經內酯化的神經結脂,亦可間接得知內酯化產物的存在。第三,由於內酯化是一種可逆反應,且天然界中存在的唾液酸醣鏈結具有多樣化的表現,若進行內酯化反應,將難只以抗體辨識或單純的薄層層析法來加以鑑定。故在此研究中,將設計帶有螢光的物質直接與細胞外的內酯化唾液酸反應,而不與未內酯化的唾液酸作用(即只與內酯環作用而不與游離之羧酸基作用),藉此直接證明生物之細胞中的確存在內酯化反應;所參與的螢光物質分成二類:第一類為合成帶生物素的聯阱或含胺基之化合物(biotinhydrazine/biotin-amine),再與帶有螢光物質的蛋白素(fluorescent-avidin ,此所指之fluorescent 為fluorescein isothiocyanate:FITC) 反應,第二類則以購買之螢光物質:ANTS (8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate)直接與細胞反應,再藉以螢光顯微鏡及flow cy-tometry 觀察細胞中內酯化產物之存在與否,然後將細胞外的物質裂解後,以質譜檢測。第四,將設計一個實驗來證明細胞表面唾液酸醣鏈結分子的內酯化,實際參與生物活性的表現;由先前之文獻得知,RC-RNase 具有唾液酸鍵結及抗癌細胞的活性,故在此以HeLa cells為材料,將其培養於酸鹼值為4 的環境中(會進行唾液酸的內酯化及水解反應) 一段時間後,再將細胞轉至中性環境下,加入RC-RNase,觀察細胞存活之情況,若細胞大量死亡,可知細胞在pH 4 時內酯化反應發生,所以當恢復之中性環境時,細胞的內酯環打開,因而提供RC-RNase攻擊之目標而促使細胞大量死亡,相反的,若細胞仍能生長,則代表細胞外的唾液酸被水解而導致RC-RNase不會攻擊細胞。

開發新穎方法及探針劑用於合成含唾液酸之抗原及找尋唾液酸轉移-林俊成


本子計畫的研究方法分為兩個部分進行

一、發展新方法合成唾液酸共軛體

合成唾液酸共軛體不外乎利用化學方法或酵素方法,酵素方法的好處為受體位向選擇性及α選擇性皆非常地高,缺點則為不同的受體位向選擇性則需要有不同的唾液酸轉移酶來執行,雖然目前已知的唾液酸轉移酶種類約十三種,但市售可得之酵素約有三種,且價格昂貴,無法用於製備各類唾液酸共軛體,合成的方法雖可得各類唾液酸共軛體,但由於唾液酸予體的反應位置為四級碳,故反應活性差,導至低產率,並產生脫水反應之副產物;又因無鄰基效應可利用,所以無法有效製備α位向唾液酸共軛體。雖然近年來有很多方法報導可得高選擇性之α唾液酸共軛體,然而反應產物中之β共軛體仍有,很難以層析方法分離去除。由於上述的這些問,發展具高α 選擇性的唾液酸予體仍有很多的地方值得探討。最好的方式來解決唾液酸化選擇性為固定anomeric 中心上的羥基立體位向於α 位置,再進行親核取代反應,即可得完全為α - 位向之唾液酸共軛體,此方法可運用於合成一級羥基受體之唾液酸共軛體, 如STn, α2-9唾液酸寡醣,但本方法則無法運用於合成二級羥基受體之唾液酸共軛體,故本計畫更進一步發展合成出1,5內醯之[2,2,2]雙環系統,將anomeric 中心固定,再進行親電子反應,則可得α 位向為單一產物, 上述之唾液酸化的方法亦有另一優點,即合成目標分子後,最後的去保護過程,會產生唾液酸五號碳為自由之胺基,故可在此處進一步地衍生化,已有文獻報導,在此處進行衍生化可增強含唾液酸抗原之引發免疫反應能力。本計畫預計合成(2-8)-(2-9), (2-9)-(2-8), 2-9 唾液酸三酸體, STn, 2-9 唾液酸寡酸及其衍生物並探討它們引發免疫反應之能力。

二、設計唾液酸轉移酶探針及從胜月太庫中篩選唾液酸轉移酶抗拮劑


在生合成唾液酸共軛體的過程中,唾液酸轉移酶利用CMP唾液酸為予體,故在本子計畫中,設計一3-氟CMP唾液酸,並由其九號碳位置連結至樹脂,光親合標定劑,或生物素,此探針可與研究之細胞溶解物混合後,經UV 燈照射,即可標定唾液酸轉移酶並分離出它們,經由二維電泳及質譜分析可研究並找出新的唾液酸轉移酶,此新酵素有可能成為發展新藥中的一個目標酵素,故在本子計畫中,將進一步設計CMP唾液酸以9號碳位置連結至樹脂上並以樹脂作為探針,再從噬菌體表達分子庫中篩選出與CMP唾液酸具強鍵結之胜月太,此胜月太可成為唾液酸轉移酶之抗拮劑。

以exo-glycals 加成方式為合成策略來探討神經及腦組織中的岩藻糖轉移酵素-林俊宏、邱繼輝


計劃中的化學與酵素學


在醣類化學中endo-glycals可被用來合成各種活性分子的起始物,著名的方法諸如Ferrier 反應及Danishefsky 的醣類組合法都使用它們來製備重要的醣類分子, 包括Lewis 及血型抗原,神經結脂,和腫瘤相關抗原(Tumor-associated antigens)。因此,與其具有類似結構的exo-glycals,也是非常好用的合成起始物,可惜有關exo-glycals的製備方法,以往非常罕見,它們的反應性研究也少有報導。我們的實驗室不久前曾發展出最為簡便、快速的方法,來合成exo-glycals。這個方法不僅具有立體選擇性,只產生(Z)- 形式異構物,而且可以應用到各種醣類上。除此之外,我們還將exo-glycals應用到醣鍵連結的形成(glycosidic bond formation),這種Ferrier 形式的醣合成反應,屬於a l l y l i crearrangement 。由於牽涉到化學鍵的斷裂,所以反應性相當的高,也具絕對的立體選擇性,可與各式各樣的含有羥基的分子反應。這個研究計畫,便是要應用上述方法來合成岩藻糖轉移酵素的分子探針,以便進一步去探討腦及神經組織中的這類酵素。為什麼要選擇這個主題呢?在中樞神經系統及神經細胞的分化上,雖然帶有岩藻糖的共軛分子扮演著重要的角色,但是相關的岩藻糖轉移酵素,它們在這些組織中的調節性機制,目前尚不清楚。由於遺傳上的缺陷,導致身體細胞的岩藻糖分佈產生異常,使得患者的心理及精神有延遲停滯的現象。含有Lewis x抗原(在乳胺醣上第三位置連接有岩藻糖,屬於三糖)的醣脂質,通常在胎兒脊髓皮質神經細胞產生時,這種醣脂質產生的量達到最高值。此外,細胞表面的醣分子,第二位置是否有岩藻糖(也就是說,α1,2-fucosylation)與神經細胞的分化,神經軸突的產生,有極密切的關係,因此,如果我們可以用化學合成的方法,製造分子來特別地標示出這些岩藻糖轉移酵素,以上所提的許多問題與關聯,將可以獲得直接的答案。此外,目前對於大多數的糖合成轉移酵素而言,它們的酵素抑制物效果並非很好,(也就是說,與酵素的結合力不強)這些酵素的活性中心擁有二個結合區,分別容納glycosyldonor 及acceptor ,由於合成上的困難,大部分文獻報導的抑制物只能含有一個部分;所以效果好的抑制物其展現出來的Ki或IC50 ,只能與酵素的受質或產物相當,範圍在10-3 到10-6M之間。我們前述所提出的"Glycosylation of exo-Glycals" ,因為可以提供一個四級碳的anomeric center ,等於在醣的1 號位置延伸出兩條支鏈,所以合成出來的分子可以同時占有酵素的donor 及acceptor 的區域,因此得以增強抑制物與酵素的結合力。在岩藻糖轉移酵素相關的研究中,另一個挑戰是蛋白質的結構。迄今沒有任何報導有關這類酵素的X-ray 結構。這類酵素大部分是來自哺乳動物,而且極少量存在於細胞膜上,因此很難同時得到大量、高純度、穩定性高的蛋白質。我們所提出的合成計劃,即是希望能夠製備不可逆的抑制物(irreversible inhibitors),使其與酵素產生共價鍵結合,這些合成分子因而有標示的效果。除了有助於蛋白質體學(proteomic analysis)上的分析之外(也就是說,在一大群蛋白質混合物中, 精確而特定標示出岩藻糖轉移酵素),還可以與質譜分析結合,用來探索酵素的活化中心及受質結合區域。此外,我們還會將組合式化學的觀念,應用到抑制物的設計與合成上。不但可快速地造成不同的變異,產生數目眾多的分子,以供篩選測試;還可以同時瞭解到:(i) GDP的部分,是否可被不同的官能基取代;(ii)這類酵素是否存在著額外的結合區域,將為抑制物的改良設計,預留空間。完整的醣質體分析(glycomics)醣質體分析(glycomics),即是針對某種細胞中所含的醣類分子,做完整的糖類型式、鍵結、與結構的分析與鑑定。技術上必須有質譜/ 質譜(MS/MS)的定序分析。文獻上已迄今採用的醣質體分析,乃是針對幾種癌細胞及生物體液作有系統地分析。因此,只要能建立完整廣泛地質譜/ 質譜斷裂型式,我們便能夠對腦及神經組織中的醣分子形式作正確地剖析。尤其重要地,將特別針對岩藻糖轉移酶,在腦與神經組織中的分佈,與同組織中醣分子所含岩藻糖存在與某否,和連接方式,作互相串聯。換句話說,這些組織中,可能因不同細胞及不同部位,岩藻糖轉移酶得存在與否和含量高低,將影響到不同醣分子的表現。這個訊息,再與所賦予的生理功能對應起來,將是用分子層次說明生理現象的最直接證據。


以質譜分析探討酵素的拓撲圖形

如前所述,哺乳動物的岩藻糖轉移酶屬於細胞膜蛋白。蛋白質與其周遭的細胞膜之間的關係。勢必決定它們結構及生理上的功能。舉例來說,神經傳導物質的受器(neurotransmitter receptor) ,它的構形改變,與其受到外界的調控和訊息傳遞,存在著重要的關聯性。由於細胞膜蛋白本身具有的高難度性。使得採用X-ray或NMR以獲得結構訊息,變得遙不可及,雖然序列的相似性比對及相關的資訊,可以提供有限的二維結構訊息。但是它們的可靠性及更深入的結構資訊,則得依賴其他的實驗方法。我們將使用質譜為主要的分析方法,來探討膜蛋白的拓撲圖形。依此來找出膜蛋白的可溶性、與穿透膜區域,如此才能進一步得知岩藻糖轉移酶,如何藉由細胞膜外的部分,與其他蛋白產生交互作用,表現其生理功能。

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